Polar MC-IMAC 填料是一種金屬親和填料,適用于純化帶有組氨酸 ( His ) 標(biāo)簽的重組蛋白，這類重組蛋白廣泛應(yīng)用于生物技術(shù)領(lǐng)域。該填料以親水性聚甲基丙烯酸酯微球?yàn)榛|(zhì)，粒徑為 30 μm 或 60 μm,孔徑為 800 Å，具有較高的物理和化學(xué)穩(wěn)定性。填料表面具 有高度的親水性,最大程度地避免了與生物類樣品的非特異性吸附。在親水性表面,以專有連接物鏈接了能螯合多價(jià)金屬離子的羧酸基團(tuán)。
Polar MC-IMAC 填料有兩種類型 : 游離酸型(Polar MC30-CA Excel 或 Polar MC60-CA Excel，羧酸 ) 和螯合鎳離子型 ( Polar MC30-Ni Excel 或Polar MC60-NiExcel)。游離酸型可用于金屬離子去除,也可根據(jù)客戶要求定制他金屬離子型填料。這兩種類 型的 IMAC 填料結(jié)構(gòu)如圖 1 所示。
該填料高度穩(wěn)定,可耐受 0.5 M NaOH 接近 100次清洗循環(huán)。螯合金屬離子的填料能在 0.1 M 乙二胺四乙酸 (EDTA) 的清洗條件下不損失金屬離子,因此每次使用后無需再補(bǔ)充金屬離子。這兩種填料都可以散裝、 FPLC 柱或常規(guī) HPLC 柱的形式提供。
| 填料類型 | Polar MC30-CA Excel, Polar MC30-Ni Excel Polar MC60-CA Excel, Polar MC60-Ni Excel |
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|---|---|---|
| 包裝條件 | 50%（v/v）懸浮液，在20%乙醇中保存 | |
| 基體 | 親水性聚甲基丙烯酸酯 | |
| 粒徑 | 20 ~ 45 μm (平均30 μm) 45 ~ 90 μm (平均60 μm) |
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| 孔徑 | 800 Å | |
| pH穩(wěn)定范圍 | 基礎(chǔ)填料Polar MC-CA Excel：1-13 | |
| 金屬離子螯合填料 Polar MC-Ni Excel：1-13 | ||
| 載量 | Polar MC30-CA Excel | >120 μeq. carboxylic group /mL |
| Polar MC30-Ni Excel | 40-60 μeq.Ni++ /mL | |
| Polar MC60-CA Excel | >100 μeq. carboxylic group /mL | |
| Polar MC60-Ni Excel | 40-60 μeq.Ni++ /mL | |
| 組氨酸標(biāo)記蛋白(His-protein)載量 | Polar MC30-Ni Excel, ~20 mg/mL Polar MC60-Ni Excel, ~15 mg/mL |
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| 操作溫度 | ≤40 °C | |
| 操作壓力 | ≤30 MPa (30 bar) | |
| 流動(dòng)相兼容性 | 水溶液，或水和乙腈、丙酮或甲醇的混合物。 常用緩沖液：磷酸鹽、三羥甲基氨基甲烷(Tris)和醋酸鹽，也與6M鹽酸胍、8M尿素、0.1 M EDTA、10 mM DTT相容 |
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| 線性流速 | ≤1800 cm/h | |
將 300 mL 組氨酸標(biāo)記蛋白粗品上樣到以 PolarMC60-Ni Excel 裝填 15x220 mm 賽分Generik FPLC柱(貨號(hào)202000-1525-AF)中。用上樣緩沖液清洗后，靶蛋白用含0.5 M咪唑的25 mM磷酸鈉緩沖液（pH8），以 7.5 mL/min 的流速洗脫（圖 2）。
上樣：溶解在25 mM磷酸鹽(pH8) + 0.5M氯化鈉緩沖液的組氨酸標(biāo)記蛋白粗品以5.0 mL/min的流速上樣；
淋洗：再用25 mM磷酸鹽(pH8) + 0.5 M氯化鈉緩沖液洗滌色譜柱；
洗脫：用含0.5 M咪唑的25 mM磷酸鹽(pH8) + 0.5 M氯化鈉緩沖液洗脫組氨酸標(biāo)記蛋白， 并收集純化組分、 淋洗液及上樣流穿液。
收集的餾分用10%三甘氨酸SDS-Pages確認(rèn)（ 圖3 ）。
泳道1：分子量階梯
泳道2：組氨酸標(biāo)記蛋白粗品
泳道3：樣品上樣后的流穿液
泳道4：上樣后清洗色譜柱的淋洗液
泳道5：洗脫靶蛋白的0.5 M咪唑洗脫液
IMAC 填料在 90 倍柱體積的 0.5 M NaOH 溶液清洗后表現(xiàn)出耐堿性和可重復(fù)使用性 ( 圖 4）。用0.5 M NaOH 溶液以 0.25 倍柱體積 /min 的流速進(jìn)行 30 次循環(huán)洗滌,總接觸時(shí)間為 2 小時(shí)后,重復(fù)使用該填料純化相同的組氨酸標(biāo)記蛋白,結(jié)果表 明填料的結(jié)合性能保持不變。
泳道 1：分子量階梯
泳道 2：組氨酸標(biāo)記蛋白粗品
泳道 3：收集的流穿液作為樣品上樣到新色譜柱上
泳道 4：用新鎳柱洗脫靶蛋白的洗脫液
泳道 5：用 30 倍柱體積的 0.5 M NaOH 溶液以 0.25 柱體積 /min 的流速清洗，總接觸時(shí)間達(dá) 2 小時(shí)后，收集到的流穿液
泳道 6：用 30 倍柱體積的 0.5 M NaOH 溶液清洗鎳柱后，靶蛋白的洗脫液
泳道 7：用 60 倍柱體積的 0.5 M NaOH 溶液以 0.25 柱體積 /min 的流速清洗，總接觸時(shí)間達(dá) 4 小時(shí)后，收集到的流穿液
泳道 8：用 60 倍柱體積的 0.5 M NaOH 溶液清洗鎳柱后，靶蛋白的洗脫液
泳道 9：用 90 倍柱體積的 0.5 M NaOH 鈉溶液以 0.25 柱體積/min 的流速清洗，總接觸時(shí)間達(dá) 6 小時(shí)后，收集到的流穿液泳道 10：用 90 倍柱體積的 0.5 M NaOH 鈉溶液清洗鎳柱后，靶蛋白的洗脫液
| 填料種類 | 粒徑 | 貨號(hào) |
|---|---|---|
| Polar MC30-CA Excel | 30 μm | 270530800 |
| Polar MC30-Ni Excel | 30 μm | 270630800 |
| Polar MC60-CA Excel | 60 μm | 270560800 |
| Polar MC60-Ni Excel | 60 μm | 270660800 |
預(yù)裝柱規(guī)格為1、4.2、5 mL，包裝規(guī)格為5 L以下及5 L、10 L、50 L
