引言

　　Introduction

　　環(huán)狀RNA（circRNA）由于其獨(dú)特的閉環(huán)結(jié)構(gòu)、高穩(wěn)定性和對(duì)外切酶的抗性，在科研和臨床應(yīng)用中展現(xiàn)出巨大潛力，成為研究基因表達(dá)調(diào)控、疾病診斷及新療法開發(fā)的重要工具。近日，中檢院在《Chemosensors》上發(fā)表的研究Study on the Characterization and Degradation Pattern of Circular RNA Vaccines Using an HPLC Method，通過SEC-HPLC方法詳細(xì)探討了circRNA疫苗的表征及降解模式，為circRNA的進(jìn)一步應(yīng)用提供參考依據(jù)（*查看底部留言區(qū)獲取文章鏈接）。文中參考USP法案推薦的mRNA聚體分析SRT SEC-1000體積排阻色譜柱，有效分離circRNA的聚集體、片段等相關(guān)雜質(zhì)，為circRNA降解研究提供關(guān)鍵信息。

背景介紹

　　CircRNA由線性mRNA進(jìn)一步環(huán)化或IVT共環(huán)化得到，無論是mRNA或者circRNA其均具有較高的分子量，相比于常規(guī)抗體、蛋白，在未變性條件下的分析檢測，常需采用大孔徑的色譜柱產(chǎn)品。而市場上大孔色譜柱相對(duì)較少，賽分科技在大孔硅膠的研究上具有豐富的經(jīng)驗(yàn)，滿足大孔分析的同時(shí)保證硅膠的機(jī)械穩(wěn)定性，適用于mRNA、DNA、病毒顆粒等大尺寸生物樣品的分析與質(zhì)量控制。

　　CircRNA反向剪接形成的獨(dú)特閉環(huán)結(jié)構(gòu)雖賦予了其高度的穩(wěn)定性，但伴隨其合成過程產(chǎn)生的聚集體、片段、開環(huán)樣品，以及儲(chǔ)存或運(yùn)輸過程的降解產(chǎn)物需進(jìn)行質(zhì)量控制。為了探究circRNA的降解機(jī)制和產(chǎn)物，研究人員參考美國藥典(USP)Analytical Procedure for Quality of mRNA Vaccines and Therapeutics第二版推薦的線性mRNA檢測方法。而近期USP發(fā)布的第三版草案中，持續(xù)推薦賽分科技SRT SEC-1000用于mRNA聚體分析，研究人員也采用該色譜柱用于circRNA的純度評(píng)估與降解模式分析。

文章概述

　　對(duì)于circRNA產(chǎn)品，其研發(fā)工藝中容易被忽略的開環(huán)RNA、聚集體以及降解產(chǎn)物等雜質(zhì)的鑒定和分離一直是一大難題，對(duì)產(chǎn)品安全性和穩(wěn)定性造成影響。文章采用賽分科技SRT SEC-1000色譜柱，實(shí)現(xiàn)了circRNA樣品中各組分的有效分離，提供了關(guān)于circRNA疫苗穩(wěn)定性、聚集物形成以及降解產(chǎn)物積累的關(guān)鍵信息，為保證疫苗質(zhì)量和安全性提供支持。

　　聚集體片段分析

　　色譜柱：SRT SEC-1000(7.8×300 mm,5 μm,1000 Å)

　　流動(dòng)相：無Rnase的磷酸鹽緩沖液(225 mM NaH2PO4+225 mM Na2HPO4,pH 7.0)

　　流速：0.3 mL/min

　　圖1.不同溫度下處理的circRNA樣品穩(wěn)定性

　　圖1是利用SRT SEC-1000色譜柱檢測circRNA樣品在4℃、25℃和37℃下的穩(wěn)定性結(jié)果。結(jié)果顯示，在4℃和25℃條件下，隨著存放時(shí)間的增加，circRNA樣品和聚集比例均發(fā)生下降，而RNA降解片段比例出現(xiàn)增加(9%~80%)。在37℃條件下，隨著存儲(chǔ)時(shí)長的增加，circRNA比例下降，mRNA降解片段比例出現(xiàn)增加，而聚集體比例會(huì)先增加后降低。因此可以推斷，在不同溫度存放過程中，circRNA樣品和聚集體的降解伴隨著mRNA降解片段的形成。

圖2. 在circRNA樣品中各組分的分析

　　圖2是對(duì)circRNA樣品中各組分進(jìn)行進(jìn)一步分析的結(jié)果。研究人員將SEC-HPLC與RP-HPLC結(jié)果相結(jié)合，實(shí)現(xiàn)了樣品中閉環(huán)、線性前體、nicked、聚體和降解產(chǎn)物的成功分離，驗(yàn)證了其從完整狀態(tài)到切口狀態(tài)再到最終降解產(chǎn)物的降解模式。

實(shí)驗(yàn)結(jié)論

　　綜上所述，研究人員使用賽分科技SRT SEC-1000體積排阻色譜柱，評(píng)估了circRNA樣品在不同溫度下的穩(wěn)定性及降解模式，較低溫度下circRNA樣品和聚集體比例均發(fā)生下降，較高溫度下在降解過程中出現(xiàn)聚集體比例先增加后降低，最終完全降解為片段的情況。該研究對(duì)于circRNA降解模式的研究為疫苗儲(chǔ)存、運(yùn)輸?shù)陌踩院陀行杂兄匾饬x。

制備收集推薦

　　CircRNA由于其環(huán)狀結(jié)構(gòu)，在分子量上通常與線性mRNA有所不同。因此在制備過程中，通過優(yōu)化SEC的分離參數(shù)和條件，可以實(shí)現(xiàn)對(duì)circRNA的高純度分離，提高circRNA的制備效率。特別是當(dāng)circRNA與線性mRNA的分子量差異較大時(shí)，SEC的分離效果尤為顯著。

　　cricRNA純化制備

　　色譜柱：SRT SEC-2000(4.6×300 mm,5 μm,2000 Å)

　　流動(dòng)相：無Rnase的TE緩沖液

圖3.柱純化富集環(huán)狀RNA樣品

圖4.凝膠電泳分析純化前后環(huán)狀RNA樣品

　　圖3是北京大學(xué)魏文勝課題組的案例（點(diǎn)此鏈接再次閱讀），研究人員采用賽分科技SRT SEC-2000色譜柱，對(duì)富含circRNA的餾分進(jìn)行柱純化，將純化前后的樣品再次進(jìn)行凝膠電泳分析（見圖4），得到高純度樣品，可用于后續(xù)藥效實(shí)驗(yàn)等操作。

案例分享

　　賽分科技大孔徑色譜柱已廣泛應(yīng)用于mRNA以及circRNA的分析。賽分科技國內(nèi)外客戶均有采用體積排阻色譜柱用于mRNA樣品分析及制備，并發(fā)表相關(guān)研究文獻(xiàn)，摘錄部分文件可再次瀏覽。

　　鏈接：點(diǎn)擊以下文章再次閱讀，通過SEC分析、制備mRNA樣品：

　　《文獻(xiàn)速遞 | 環(huán)狀mRNA用于癌癥治療》

　　《文獻(xiàn)速遞 | SRT SEC分離純化環(huán)狀RNA》

　　《文獻(xiàn)速遞 | 光散射技術(shù)對(duì)rAAV及mRNA-LNP樣品生物物理表征》

　　《文獻(xiàn)速遞|高純度circRNA制備收集助力TCR-T藥物研發(fā)》

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