寡核苷酸（Oligonucleotides）是短鏈核苷酸總稱，是繼小分子類藥物和抗體藥物后的再一次研發(fā)浪潮，也是近幾年研究的熱點領(lǐng)域。寡核苷酸藥物也稱小核酸藥物，包括反義寡核苷酸（ASO）、小干擾RNA（siRNA）、微小RNA（miRNA）、核酸適配體（Aptamer）等。目前，全球已有19款寡核苷酸藥物獲批上市（3款已退市），在市的共有9款A(yù)SO藥物、6款siRNA藥物和1款核酸適配體。寡核苷酸藥物具有研發(fā)周期短、特異性強(qiáng)、高效性和長效性等明顯性優(yōu)勢，成為近年來全球資本和藥企爭相布局的新賽道。

表1. 2024年已上市小核酸藥物梳理

背景簡介

　　寡核苷酸化學(xué)合成方面包括核苷酸單體合成、遞送系統(tǒng)合成和寡核苷酸偶聯(lián)物合成等，修飾包括核糖、堿基、骨架和遞送系統(tǒng)的修飾。堿基合成一般分4步：脫保護(hù)（Deprotection, DET）、縮合連接（Coupling, CPL）、加帽反應(yīng)（Capping，CAP）和氧化穩(wěn)定（Oxidation, OXI），寡核苷酸合成一般需重復(fù)上述步驟添加核苷酸殘基以產(chǎn)生特定序列。合成過程伴隨雜質(zhì)產(chǎn)生，如圖1結(jié)構(gòu)，寡聚體缺失核苷（“N-1雜質(zhì)”）或具有磷酸二酯鍵而不是所需的硫代磷酸酯鍵（“P=O 雜質(zhì)”），在合成期間或之后暴露在氧化條件中將 P=S 鍵轉(zhuǎn)化為 P=O 鍵以形成 P=O 雜質(zhì)。這些雜質(zhì)的分離和去除對下游工藝開發(fā)、填料的選擇提出了一定的要求。

圖1. 寡核苷酸及其類似物結(jié)構(gòu)示意圖

純化方案

　　根據(jù)寡核苷酸藥物典型生產(chǎn)工藝（如圖2），寡核苷酸下游工藝的常見N-X、N+Y、修飾副產(chǎn)物、脫嘌呤成分等雜質(zhì)（如表2），常用陰離子層析、反相層析、疏水層析等方法去除。陰離子層析通用性強(qiáng)、成本低且分辨率高，通常為寡核苷酸純化的第一選擇，隨核苷酸鏈長逐漸增加，相關(guān)雜質(zhì)的去除難度越大，在陰離子無法滿足需求的情況下，可選擇保留端基DMT方式，采用反相模式純化。賽分科技推薦Proteomix POR15/30-MQ和Bio-C18填料，主要適用于siRNA藥物和純化難度較高的寡核苷酸藥物生產(chǎn)純化，滿足高載量、高純度以及高回收率的需求。

表2. 寡核苷酸制備雜質(zhì)及層析方法

圖2. 寡核苷酸藥物制備工藝示意圖

　　01陰離子交換層析

　　Proteomix POR MQ填料均為親水化改性聚苯乙烯/二乙烯基苯（PS/DVB）微球，填料表面經(jīng)賽分科技特殊親水涂層處理，具有更好的親水性，最大程度地避免了與生物類樣品的非特異性吸附。Proteomix POR MQ填料分為15 μm與30 μm兩種粒徑，小粒徑填料具有更高的分辨率及載量；填料配基為混合模式陰離子交換基團(tuán)，能夠提高對N-1、N-2雜質(zhì)的分離度，對長鏈（超過50nt）或疏水性較強(qiáng)（DMT on）的寡聚核苷酸分子的純化尤其推薦。若MQ結(jié)合力過強(qiáng)，且非防爆車間無法使用有機(jī)溶劑情況下，推薦選擇Proteomix POR15/30-Q，且Proteomix POR15/30-Q可用于柱上脫DMT保護(hù)等操作。

表3. 陰離子交換層析填料技術(shù)參數(shù)

應(yīng)用案例一

　　Proteomix POR30-MQ純化某siRNA樣品，樣品長度: 21 nt，關(guān)鍵去除雜質(zhì)：N-1、N-2、P=O、脫嘌呤雜質(zhì)等，上樣載量為10 mg/mL，純化圖譜見圖3。樣品純度純化前為81.2%，純化后為94.96%，回收率74%，競品填料純度為95.04%，回收率為43.75%，兩款填料純度保持一致，Proteomix POR30-MQ回收率明顯高于競品填料。

圖3. siRNA樣品純化及UPLC分析圖譜

應(yīng)用案例二

　　Proteomix POR30-MQ純化某ASO樣品，關(guān)鍵去除雜質(zhì)：N-1、N-2、P=O雜質(zhì)等，上樣載量5 mg/mL，純化圖譜見圖4。樣品純度純化前為80.73%，經(jīng)Proteomix POR30-MQ純化后為95.00%，競品填料純化后純度為91.92%，Proteomix POR30-MQ純化性能更佳。

圖4. ASO樣品純化及HPLC分析圖譜

　　02反相層析

　　完全脫保護(hù) (DMT-off) 的寡核苷酸可以通過陰離子交換層析 (IEX) 進(jìn)行純化。部分樣品結(jié)構(gòu)性質(zhì)特殊，下游層析難度大，可保留DMT端基，采用反相純化后脫保護(hù)，再采用陰離子精純的方法。反相層析具備高分辨率優(yōu)勢，在填料選擇上，以高分辨率硅膠反相填料為主，賽分科技推薦C18填料，高載量，高選擇性和分離效率，使純化后的樣品純度及N-X、P=O等關(guān)鍵性指標(biāo)的控制上滿足要求。Bio-C18應(yīng)用于某寡核苷酸樣品純化，純化后達(dá)到生產(chǎn)標(biāo)準(zhǔn)。BR-C18孔徑較小，對于分子量偏小的樣品載量更高。表4為C18填料的技術(shù)參數(shù)，文末可填寫問卷信息申請試用。

表4. C18填料的技術(shù)參數(shù)

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　　*參考文獻(xiàn)：Klabenkova K, Fokina A, Stetsenko D. Chemistry of Peptide-Oligonucleotide Conjugates: A Review. Molecules. 2021 Sep 6;26(17):5420. doi: 10.3390/molecules26175420.