去年11月，禮來(lái)開(kāi)發(fā)的雙靶點(diǎn)激動(dòng)劑藥物替爾泊肽（Tirzepatide）減重適應(yīng)癥在美國(guó)獲批，立刻引爆市場(chǎng)。作為第一款獲批減肥適應(yīng)癥的雙靶點(diǎn)GLP-1藥物具有更優(yōu)于司美格魯肽的臨床效果，在獲批后帶來(lái)單季度超14億美元的業(yè)績(jī)，今年用于2型糖尿病藥物Mounjaro與肥胖藥物Zepbound合計(jì)23.24億美元。替爾泊肽的火熱進(jìn)一步帶動(dòng)研究者對(duì)于雙靶點(diǎn)/三靶點(diǎn)GLP-1藥物的研發(fā)，國(guó)內(nèi)多靶點(diǎn)GLP-1多肽藥物研發(fā)進(jìn)展見(jiàn)表1。
表1. 國(guó)內(nèi)多靶點(diǎn)GLP-1藥物研究進(jìn)度
*數(shù)據(jù)來(lái)源：公司官網(wǎng)、數(shù)據(jù)庫(kù)檢索
替爾泊肽是GLP-1R以及GIPR雙靶點(diǎn)藥物，兼具GLP-1R受體和GIPR受體激動(dòng)活性，且結(jié)構(gòu)設(shè)計(jì)中避開(kāi)二肽基肽酶Ⅳ（DPP-4）降解活性位點(diǎn)。其多肽鏈（結(jié)構(gòu)示意圖見(jiàn)圖1）存在兩個(gè)非天然存在的氨基酸，位于2和13位的非編碼氨基異丁酸殘基，另外在20位氨基酸殘基處引入長(zhǎng)鏈脂肪酸，進(jìn)一步延長(zhǎng)藥物半衰期。由于其結(jié)構(gòu)的特殊性，一般采用化學(xué)合成的方式生產(chǎn)?；瘜W(xué)合成一般分為固相合成（SPPS）和液相合成（LPPS），兩種合成工藝各有優(yōu)缺點(diǎn)，對(duì)于長(zhǎng)鏈多肽藥物采用固液混合合成（SPPS+LPPS）的方式很大程度上降低工藝難度，提高產(chǎn)品收率，對(duì)于下游純化更加友好。
圖1. 替爾泊肽多肽鏈結(jié)構(gòu)示意圖
01
替爾泊肽反相純化方案
賽分科技采用一步反相或兩步反相純化方案用于替爾泊肽樣品的純化工藝開(kāi)發(fā)。采用的純化填料產(chǎn)品為Bio-C8(2)，粒徑10 μm，純化工藝簡(jiǎn)單，采用不含鹽流動(dòng)相，醋酸水+乙腈體系作為流動(dòng)相，純化目的樣品，減少后續(xù)脫鹽步驟，圖2為其純化圖譜。
圖2. 粗品純化圖譜
純化后對(duì)洗脫收集樣品合并分析，滿(mǎn)足高載量（26.8 mg/g）的同時(shí)，一步反相純化將粗品純度為80.78%的樣品提升至99.03%，且最大單雜小于0.3%，純化前后樣品分析圖譜見(jiàn)圖3，收率為80.04%。
圖3. 替爾泊肽樣品純化前后純度分析圖
此外，對(duì)于存在特別難去除的雜質(zhì)或者樣品純度相對(duì)較低的情況，采用同一款填料兩步反相層析解決純化問(wèn)題。圖4為第二步反相純化圖譜，同樣采用Bio-C8(2)硅膠反相填料，載量為1.72%，對(duì)比第一步反相純化對(duì)雜質(zhì)類(lèi)型的去除各有側(cè)重，有效提高樣品純度，對(duì)純化圖譜分段收集樣品進(jìn)行分析。
圖4. 第二步反相純化圖譜
圖5. 第二步反相純化后樣品純度分析
第二步反相純化進(jìn)一步去除雜質(zhì)，通過(guò)對(duì)流動(dòng)相條件的調(diào)整實(shí)現(xiàn)目標(biāo)純度達(dá)99.80%，最大單雜小于0.1%（分析圖譜見(jiàn)圖5）。純化方案中可以通過(guò)加入不同緩沖鹽種類(lèi)調(diào)整對(duì)于關(guān)鍵雜質(zhì)的去除效果，保證最終產(chǎn)品的質(zhì)量符合要求。表2為案例中純化工藝的具體數(shù)據(jù)分析。且兩步純化工藝均保持高回收率，兩步反相純化后總收率可達(dá)74.35%。
表2. 兩步反相純化替爾泊肽工藝數(shù)據(jù)分析
02
替爾泊肽反相純化工藝小結(jié)
01.Bio-C8(2)反相填料分辨率高，一步反相純化粗品替爾泊肽純度可達(dá)99%，最大單雜可控制在0.3%以下；
02.Bio-C8(2)反相填料純化載量高、回收率高，每一步驟的純化收率都大于80%，保障終產(chǎn)品收率，適合放大生產(chǎn)；
03.同一款填料可用于兩步反相純化，通過(guò)調(diào)整流動(dòng)相條件去除不同雜質(zhì)，滿(mǎn)足最終質(zhì)量要求。
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賽分科技對(duì)該類(lèi)藥物的生產(chǎn)工藝進(jìn)行探索，針對(duì)發(fā)酵生產(chǎn)和化學(xué)合成的司美格魯肽開(kāi)發(fā)出純化效率高、通用性強(qiáng)的純化工藝。對(duì)于發(fā)酵類(lèi)GLP-1多肽樣品僅使用兩款填料（Generik MC60-HIC Butyl+Bio-C8(2)）即可完成粗品到成品的純化。歡迎點(diǎn)擊閱讀“省時(shí)省力又省錢(qián)的GLP-1藥物純化方案”。
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